使用单倍体交配策略在酵母中合成异聚多亚基多肽的方法
2020-01-12

使用单倍体交配策略在酵母中合成异聚多亚基多肽的方法

本发明提供了用于在能交配的酵母中合成和分泌重组异聚多亚基蛋白的方法。将第一种表达载体转化到第一种单倍体细胞中;并将第二种表达载体转化到第二种单倍体细胞中。鉴定各自合成不同多肽的这两种经转化单倍体细胞,然后进行遗传杂交或融合。将由此产生的二倍体菌株用于生成和分泌完整组装且有生物学功能的异聚多亚基蛋白。

用于本发明方法的表达载体还将包含酵母特异序列,包括用于鉴定经转化酵母菌株的可选择营养缺陷型或药物标记。药物标记还可用于扩增酵母宿主细胞中的载体拷贝数。

将目的多肽编码序列与为了在酵母细胞中表达多肽而提供的转录和翻译调控序列可操作连接。这些载体成分可以包括但不限于下列一项或多项:增强子元件、启动子、和转录终止序列。还可以包含用于分泌多肽的序列,例如信号序列等。酵母复制起点是可选的,因为表达载体常常整合到酵母基因组中。

本发明的方法提供了用于表达分泌型活性蛋白的方法,特别是分泌型活性抗体,其中"活性抗体"在用于本文时指至少两种正确配对链的正确折叠的多聚物,它能够精确结合它的相关抗原。活性蛋白的表达水平通常是至少约50mg/升培养物,更常见的是至少约IOOmg/升,优选至少约500mg/升,而且可以是1000mg/升或更多。

能交配的酵母物种:这些酵母物种以单倍体和二倍体形式存在。二倍体细胞在合适条件下可以以二倍体形式增殖无限代。二倍体细胞还能够形成孢子而形成单倍体细胞。另外,通过营养缺陷型二倍体的交配,连续交配可能产生四倍体菌株。

定义

特别感兴趣的是毕赤氏酵母属。毕赤氏酵母属包括许多物种,包括巴斯德毕赤氏酵母、Pichiamethanolica、和多形汉逊氏酵母(Hansenulapolymorpha,Pichiaangusta)。最优选的物种是巴斯德毕赤氏酵母。

术语"期望蛋白"或"靶蛋白"可以互换使用,通常指具有两条或多条不同多肽链的任何分泌蛋白,其中这些链是独立合成的,即不是由一条多肽链的翻译后切割产生的。多肽对于酵母是异源的,即外来的。优选的是,使用哺乳动物多肽,即在哺乳动物基因组中编码的多肽。

重组蛋白生产是高通量筛选、功能验证、结构生物学、和药物多肽生产的一项必需工作。大肠杆菌是广泛用于表达异源蛋白的生物体,因为它易于在便宜的培养基上生长至高细胞密度,且具有完善建立的遗传技术和表达载体。然而,这对高效生产活性生物分子并非总是足够的。为了保持生物学活性,多肽链必需折叠成正确的天然三维结构,包括适当形成二硫键,而且可能还需要正确联合多种链。

可以将两种经转化单倍体细胞遗传杂交,并通过它们的杂合营养需求选择源自此交配事件的二倍体菌株。或者,将两种经转化单倍体菌株的群体制成原生质球并融合,重建并选择二倍体后代。通过这两种方法,可以鉴定并选择性培养二倍体菌株,因为与它们的单倍体亲本不同,它们没有相同的营养需求。例如,可以在基本培养基中培养二倍体细胞。二倍体合成策略具有某些优势。二倍体菌株具有通过潜在突变的更广泛互补而提高异源蛋白水平的潜力,其中所述突变可能影响重组蛋白的生成和/或分泌。

用于本发明方法的表达载体还将包含酵母特异序列,包括用于鉴定经转化酵母菌株的可选择营养缺陷型或药物标记。药物标记还可用于扩增酵母宿主细胞中的载体拷贝数。